制備DLIN-MC3脂質(zhì)納米顆粒

　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/span>

　　分別以DLIN-MC3為陽(yáng)離子主要脂質(zhì)，參照文獻(xiàn)方法制備包載mRNA的LNP。

　　實(shí)驗(yàn)原理：

　　DLIN-MC3是可解離脂質(zhì)，在酸性條件下可質(zhì)子化形成陽(yáng)離子脂質(zhì)，通過(guò)靜電作用于帶負(fù)電的mRNA結(jié)合，形成載有mRNA的脂質(zhì)納米顆粒(lipid nanoparticles,LNPs)。常見(jiàn)的制備方法有薄膜-水化法、溶劑注入法、高壓均質(zhì)法和微流控法等方法，在本實(shí)驗(yàn)中采用微流控法，讓脂質(zhì)溶液與和mRNA溶液在微混合器中充分、迅速的混合，形成粒徑均一的LNP。由于脂質(zhì)溶解于乙醇中，核酸溶解于酸性緩沖液中，因此需要透析去除殘余的乙醇并換液至PBS。

　　實(shí)驗(yàn)材料：

　　DLIN-MC3、DSPC、DMG-PEG2000、冰醋酸、三水醋酸鈉

　　實(shí)驗(yàn)步驟：

　　1、 配置脂質(zhì)乙醇溶液：

　　　　a) LNP 的成分與分子量見(jiàn)下表：

　　百分比來(lái)源于前期研究，并不一定與 onpattro 和 mRNA-1273 相同。

　　　　b)每種成分別配置三個(gè)濃度：8 mM（約5 mg/ml）、12 mM（約7.5 mg/ml）和16 mM（約10 mg/ml）。

　　2、 計(jì)算 mRNA 濃度：

　　　　a) 根據(jù) N/P=6，F(xiàn)RR=3 計(jì)算所需 RNA 濃度。

　　　　b) RNA 的堿基的平均分子量為340，每個(gè)堿基攜帶1 個(gè)磷酸，因此RNA 中的含磷量為3.1 nmol/μg.

　　　　c) 計(jì)算氮磷比時(shí)僅計(jì)算主要脂質(zhì)中的氮原子數(shù)，因此每摩爾混合脂質(zhì)中含有 0.5 摩爾 N。

　　3、 配置 mRNA-醋酸緩沖液：

　　　　稱(chēng)取3.2g三水醋酸鈉，8ml冰醋酸，定容于1000ml。加入相應(yīng)梯度的mRNA

　　4、 微流控混合：

　　　　a. 將脂質(zhì)-乙醇溶液過(guò) 0.22 μm 疏水聚四氟乙烯膜，mRNA-檸檬酸緩沖液過(guò) 0.22 μm 親水聚四氟乙烯膜，過(guò)膜后裝入微量注射器中。

　　　　b. 以FRR=3 ，磷脂和緩沖液以0.2ml/min和0.6ml/min，通過(guò)nexstarnano1芯片，混合。

　　5、 透析與儲(chǔ)存：

　　　　a) 制備后放入透析管（Slide-A-Lyzer™ MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 0.5 mL）中加入 14 ml PBS在搖床上透析，2 小時(shí)后換液，直至 18 小時(shí)后透析結(jié)束。

　　　　b) 保存于 4℃待用。

實(shí)驗(yàn)名稱(chēng)：LNP 包封率測(cè)定

　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/span>

　　　　對(duì)制備的 LNP 包封 mRNA 的效果進(jìn)行測(cè)定

　　實(shí)驗(yàn)原理：

　　　　Quant-iT™RiboGreen®RNA 試劑是一種超靈敏的熒光核酸染色劑，可檢測(cè)溶液中 1-200 ng 的核酸，這種核酸染料無(wú)法透過(guò) LNP，因此只有游離的未被 LNP 包載的核酸可以被結(jié)合。Triton-100 作為一種表面活性劑常被用做破乳劑，使用 1%的 Triton-100 處理獲得的 LNP-mRNA 可以使包載的核酸釋放，得到總核酸量。通過(guò)計(jì)算破乳前后核酸量的差異得到載藥量，再除以總核酸量即可得到包封率，即：

包封率（%）=（破乳后定量-破乳前定量）/破乳后定量

　　實(shí)驗(yàn)材料：

　　　　Quant-iT ™ RiboGreen ™ RNA   檢 測(cè) 試 劑 盒 （ Thermo  Fisher ， R11490 ）、 Triton ™ X-100

　　　　（SIGMA-ALDRICH，T8787-100ML）、DEPC 水、CellCarrier-96 Ultra Microplates  （ PerkinElmer，6055308）、 LNP-mRNA

　　實(shí)驗(yàn)步驟：

　　　　1. LNP 制備：

　　　　　　見(jiàn) LNP 制備流程。

　　　　2. 試劑準(zhǔn)備（詳細(xì)參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)）：

　　　　　　將 20xTE 用 DEPC 水稀釋至 1x；

　　　　　　用稀釋好的 1XTE 稀釋試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋成 2 μg/mL 及 100 ng/mL 兩種終濃度；

　　　　　　用 1xTE 稀釋試劑盒中的 QuantiT™ RiboGreen® Reagen，稀釋成 200 倍及 2000 倍兩種終濃度； 按照下表在 CellCarrier-96 Ultra Microplates 中加入以下試劑，做復(fù)孔：

High range

Low range

1. LNP 破乳

將 Triton-100 用 1xTE 稀釋到 2%，取 100 μl 加入 CellCarrier-96 Ultra Microplates，加入 1 μl 制備好的

LNP，處理 5 分鐘，加入 100 μl 200-fold diluted quant-iT RiboGreen Reagent。

2. LNP 游離核酸測(cè)定

在 CellCarrier-96 Ultra Microplates 中加入 100ul1xTE，取 1μl 制備好的 LNP 加進(jìn)去，混勻，加入 100 μl l2000-fold diluted quant-iT RiboGreen Reagent。

3. 讀板

使用 SPARK 讀取熒光強(qiáng)度，激發(fā)光設(shè)置為 480 nm，發(fā)射光為 520 nm

4. 數(shù)據(jù)處理

1） 標(biāo)曲制備

High range	Low range

2) 樣品定量

載藥量=破乳后讀值-破乳前讀值包封率（%）=載藥量/破乳后讀值